GMO soybean CRISPR-Cas9

         

         ปัจจุบันการผลิตอาหารสัตว์ในประเทศไทยผลิตอาหารสัตว์จำนวน 20.8 ล้านตัน ซึ่งความต้องการอาหารสัตว์ของสุกรและไก่เนื้อรวมกันกว่า 70 เปอร์เซ็นต์ ในการผลิตอาหารสัตว์ของสุกรและไก่เนื้อวัตถุดิบโปรตีนหลักคือ กากถั่วเหลือง ซึ่งมีสัดส่วนการใช้เป็นวัตถุดิบอาหารสัตว์ถึง 28 เปอร์เซ็นต์ และเป็นวัตถุดิบอาหารสัตว์ที่ประเทศไทยผลิตได้ไม่เพียงพอต่อความต้องการจำเป็นต้องมีการนำเข้า การใช้ประโยชน์จากกากถั่วเหลืองให้ได้มากที่สุดจึงเป็นประเด็นที่สำคัญ Trypsin inhibitor เป็นสารยับยั้งการใช้โภชนะที่พบในกากถั่วเหลืองทำให้การใช้ประโยชน์ได้จากกากถั่วเหลืองลดลง ในอุตสาหกรรมการผลิตอาหารสัตว์มีการนำถั่วเหลืองและกากถั่วเหลืองมาผ่านความร้อนเพื่อลดสารยับยั้งการใช้ประโยชน์ได้และทำให้สัตว์สารมารถนำไปใช้ประโยชน์ได้ดีขึ้น แต่ถึงอย่างนั้นกระบวนการดังกล่าวก็ยังมีข้อจำกัด คือ ปริมาณของTrypsin inhibitor ในถั่วเหลืองหรือกากถั่วเหลืองที่ยอมรับได้คือ ต่ำกว่า 5 mg/g ของตัวอย่างกากถั่วเหลือง ซึ่งยังคงมี Trypsin inhibitor หลงเหลืออยู่ทำให้สัตว์ใช้ประโยชน์ได้ไม่เต็มประสิทธิภาพ แนวทางการแก้ไขปัญหาอย่างหนึ่งที่เป็นที่พูดถึงในปัจจุบันคือการดัดแปลงพันธุกรรมของกากถั่วเหลืองโดยใช้ Biotechnology ที่เรียกว่า CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9  

          CRISPR ย่อมาจาก Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats คือ รูปแบบของลำดับ DNA ที่พบในจีโนมของเชื้อแบคทีเรียและจุลินทรีย์อื่นๆ โดยเมื่อเชื้อแบคทีเรียถูกคุกคามด้วยเชื้อไวรัส ระบบภูมิคุ้มกันของแบคทีเรียจะใช้ CRISPR ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของภูมิคุ้มกันของแบคทีเรียเข้าทำลายพันธุกรรมของเชื้อไวรัสโดยการตัดทำลายพันธุกรรมของเชื้อไวรัสจนไม่เป็นอันตรายต่อเชื้อแบคทีเรีย เรียกว่า CRISPR-Cas9  

ส่วนประกอบหลักของ CRISPR-Cas9

1. crRNA มีไกด์อาร์เอ็นเอซึ่งหาที่ตั้งของดีเอ็นเอของโฮสต์พร้อมกับตำแหน่ที่จับกับ tracrRNA (มักอยู่ในรูปห่วง, hairpin loop) เกิดเป็นกลุ่มรวมพร้อมปฏิบัติการ

2.tracrRNA จับกับ crRNA และเกิดเป็นกลุ่มรวมพร้อมปฏิบัติการ

3.sgRNA ย่อมาจาก Single guide RNAs เป็นการรวมกันของอาร์เอ็นเประกอบด้วย ด้วย tracrRNA และ crRNA อย่างน้อยหนึ่งชิ้น

4. Cas9 โปรตีนที่รูปแบบพร้อมปฏิบัติการสามารถปรับแต่งดีเอ็นเอได้ มีหลายรูปแบบที่มีหน้าที่แตกต่างกัน (เช่น การตัดสายเดี่ยว การตัดสายคู่ การจับกับดีเอ็นเอ) เป็นผลจากหน้าที่ของ Cas9 ในการรู้และจำตำแหน่งดีเอ็นเอ

ระบบ CRISPR-Cas9 ถูกปรับแต่งเพื่อแก้ไขจีโนม จีโนมสามารถถูกตัดในตำแหน่งที่ต้องการ โดยการส่งแคสไนน์นิวคลีเอส (Cas9 nuclease) ประกอบกับไกด์อาร์เอ็นเอ (guide RNA, gRNA) เข้าไปในเซลล์ ทำให้สามารถกำจัดยีนที่มีอยู่หรือเพิ่มยีนใหม่เข้าไปได้ CRISPR-Cas9 มักใช้ Plasmid เพื่อบุกรุก (transfect) เซลล์เป้าหมาย การออกแบบ crRNA ให้มีความจำเพาะกับยีนเป้าหมายมีความจำเป็นเพราะ Cas9 จะใช้ crRNA เพื่อระบุและจับโดยตรงระหว่าง crDNA จับกับลำดับเบสของยีนเป้าหมายที่ต้องการแก้ไขเท่านั้น จากนั้น Cas9 จะตัด DNA เป้าหมายที่ตำแหน่งจำเพาะ กระบวนการซ่อมแซมจะเกิดขึ้นและมีความเป็นไปได้สูงที่จะเกิด mutation ทำให้การแสดงออกของยีนถูกยับยั้งในกรณีที่มีความต้องการแทรกส่วนของ DNA เข้าไปในช่องว่างจากการตัดจำเป็นต้องมีต้นแบบการซ่อมแซม (repair template) ซึ่งถูกออกแบบให้สามารถแทรกเข้าไประหว่าง DNA เป้าหมายที่ถูกตัด โดยจะต้องมีลำดับเบสที่เข้าคู่กับลำเบสของยีนเป้าหมายด้านใดด้านหนึ่ง

Tripsin inhibitor
          เป็นสารยับยั้งการใช้ประโยชน์ที่มีอยู่ในถั่วเหลืองมากกว่า 5 ชนิด แต่ตัวหลักมีอยู่ 2 ชนิดคือ Kunitz  และ Bowman-Brik inhibitor ซึ่งพบอยู่ในเมล็ดถั่วเหลืองดิบ มีผลยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ Trypsin โดยเกาะรวมกับเอนไซม์ ทำให้ความสามารถในการทำงานของ Trypsin ลดลง
          Kunitz trypsin inhibitor (KTI) โครงสร้างของ KTI ประกอบด้วยกรดอะมิโน 181 หน่วย มีน้ำหนักโมเลกุล 21,384 ดัลตัน ซึ่งสายโพลีเปปไทด์มีพันธะ disulfide 2 แห่ง พันธะ disulfide แรกเชื่อมต่อ ระหวา่งกรดอะมิโนหน่วยที่ 39 และ 86 ส่วนอีกพนัธะหนึ่งเชื่อมต่อเป็น loop ที่หน่วย 136 และ 145 โดย KTI มี active center ที่ให้เอนไซม์เกาะที่ตำแหน่งพันธะที่ 63(Arg) – 64(lle) จะยับยั้งเฉพาะเอนไซม์ทริปซิน ในบรรดาสารยับยั้งเอนไซม์ทริปซินทั้งหมด KTI เป็นสารที่มีบทบาทในการลดคุณค่าทาง โภชนาการมากที่สุด ในกากถั่วเหลืองมีประมาณ 1.4 เปอร์เซ็นตข์องน้ำหนัก
          Bowman-Birk inhibitor (BBI) มีน้ำหนักโมเลกุล 7,861 ดัลตัน ประกอบด้วยกรดอะมิโน 71 หน่วย ซึ่งสายโพลีเปปไทด์ มีพันธะ disulfide 7 แห่ง โดยโปรตีนชนิดนี้มีคุณสมบัติยับยั้งเอนไซม์ทริปซินที่พันธะ 16(Lys) – 17(Ser) ส่วน inhibiting site ที่ยับยั้งเอนไซม์ไคโมทริปซินอยู่ที่พันธะ 44(Leu) – 45(Ser) มี ประมาณร้อยละ 0.6 ของน้ำหนัก
การใช้เทคนิค CRISPR-Cas9 ในการยับยั้งการแสดงออกของ Trypsin inhibitor gene

      Trypsin inhibitor gene ที่พบหลักๆมี 2 ชนิดคือ Kunitz trypsin inhibitor (KTI) และ Bowman-Birk inhibitor (BBI) การยับยั้งการแสดงออกของยีนทั้ง 2 ชนิด อาจจะเป็นการยับยั้งการสร้าง Trypsin inhibitor วิธีการทำได้โดยการใช้ Plasmid บุกรุกเข้าสู่เซลล์เป้าหมาย สิ่งสำคัญคือการสร้าง Plasmid โดยการออกแบบส่วนของ crRNA ให้มีความจำเพาะกับลำเบสบางส่วนของ KTI หรือ BBI gene ประมาณ 20 นิวคลีโอไทด์

          กลไกการทำงานของ CRISPR-Cas9 โดย Cas9 จะเข้าไปตัดสาย DNA ที่มีลำดับเบสจำเพาะ เมื่อสาย DNA ขาดจะเกิดการซ่อมแซมและอาจทำให้เกิด mutation ซึ่งเป็นการยับยั้งการแสดงออกของยีน

 

          ความเป็นไปได้ในการสร้างถั่วเหลือง GMO ที่ปราศจาก Trypsin inhibitor ในขณะนี้อาจจะยังเป็นเพียงแค่ทฤษฎีที่มีความเป็นไปได้เท่านั้น ซึ่งมีข้อที่ควรคำนึงถึงหลายข้อคือ การยับยั้งการแสดงออกของ Trypsin inhibitor gene จะส่งผลอย่างไรต่อถั่วเหลืองซึ่งยังไม่มีการศึกษาในเรื่องนี้ นอกจากนั้นการเลือกตำแหน่งในการตัด Trypsin inhibitor gene ควรจะทำที่ตำแหน่งใดก็เป็นเรื่องที่ยังต้องการข้อมูลเพิ่มเติม แต่ถึงอย่างไรด้วยเทคโนโลยีในปัจจุบันอาจจะไม่ใช่เรื่องที่เป็นไปได้ที่เราจะสร้างถั่วเหลืองที่ปราศจาก Trypsin inhibitor ได้สำเร็จ

บรรณานุกรม

1. คริสเปอร์. (2561, 1 สิงหาคม). ใน วิกิพีเดีย สารานุกรมเสรี. สืบค้นเมื่อ 10 กุมภาพันธุ์ 2562, จาก

          http://th.wikipedia.org/wiki/คริสเปอร์

2. บุญธรรม อร่ามศิริวัฒน์. (2561). แนวโน้มวัตถุดิบอาหารสัตว์ปี 2562. การประชุมสัมมนาวิชาการครั้งที่ 5/2561

          จัดโดยสมาคมนิสิตเก่าสัตวแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, กรุงเทพมหานคร

3. ลภัสรดา สังข์แก้ว. (2559). ผลการใช้ถั่วเหลืองไขมันเต็มในอาหารต่อสมรรถภาพการผลิตของไก่กระทง.

          มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์, สงขลา

4. วสุ ศุภรัตนสิทธิ. (2559). CRISPR/Cas9 ความหวังใหม่สำหรับการรักษาโรคต่างๆในระดับสารพันธุกรรม.

          สืบค้นจากhttps://www.pharmacy.mahidol.ac.th/th/knowledge/article/364/CRISPR/Cas9

5. สุภาพรรณ เพ็งเพชร. (ม.ป.ป.). กากถั่วเหลือง (Soybean meal, SME ). สืบค้นจาก

          http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:http://www.agri.ubu.ac.

          th/~kanjana/1203321/Data/soybean.doc

ผู้จัดทำ

1. นายศิรางกูร         ศรสันติ์         B5850044
    (ความหมายของชื่อคือ เชื้อสายของลำธาร)

2. นางสาวจินตนา     วิโสรัมย์         B5851300
    (ความหมายของชื่อคือ ความคิด)

3. นางสาวณัจรีย์      มลาศิลป์        B5853625
    (ความหมายของชื่อคือ ติดตามนักปราชญ์)

4. นางสาวณัฐณิชา    หงษ์สำโรง      B5853700
    (ความหมายของชื่อคือ ฉลาดและบริสุทธิ์)